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揭秘冬虫夏草第三章 冬虫夏草的生物特性

一、冬虫夏草菌

 

1、冬虫夏草菌生活史

冬虫夏草菌学名叫中国被毛孢( Ophiocordyceps.sinensis),是一种子囊菌,专性寄生于蝙蝠蛾幼虫。

其生活史分有性和无性两个世代,世代交替,相应有性世代称为有性型,无性世代称为无性型。整个循环过程为冬虫夏草的子实体产生子囊孢子,子囊孢子萌发出芽管感染幼虫后,进入血淋巴形成虫菌体,营寄生生活,幼虫发病死亡前后,虫菌体发芽形成菌丝,进入腐生阶段。此阶段菌丝通过生长一方面产生分生孢子,分生孢子发芽继续直接形成菌丝,再后形成坚硬的菌核,菌丝还可穿出体外继续生长。另一方面菌丝生长到一定阶段,在虫体头部分化形成子实体,子实体再产生子囊孢子。

从菌核的形成到子实体再到子囊孢子形成为有性阶段;从虫菌体到孢梗束再到分生孢子为无性阶段。冬虫夏草以何种方式进行有性繁殖,目前虽有学者在进行探索,但机制尚不清楚。在人工培养基液体发酵等实际生产中多为无性繁殖[69-71]

 

1.1冬虫夏草有性型

1.1.1菌核

蝙蝠蛾幼虫感染冬虫夏草菌后,菌体以幼虫体内的物质为营养,生长蔓延,接着充满整个幼虫虫体,最后菌丝密集成坚硬的组织。一般来说,在不良的环境条件下,菌丝密集成坚硬的组织外侧,会形成更坚硬的皮壳起到保护作用,人们称该类组织为菌核。由于冬虫夏草是利用寄主的外骨骼代替皮壳,只有内部的组织和菌核结构一样,人们把这类组织称为假菌核。 

 

 IMG_256

 
天然冬虫夏草虫体内的菌核
 

1.1.2子实体

子实体是冬虫夏草进行有性繁殖的产孢构造,由已组织化了的菌丝体组成。

冬虫夏草菌侵入虫体后,菌丝体吸取虫体内的蛋白质、脂肪、体液作为自身营养而繁衍,以至菌丝充满整个虫体体腔。染病幼虫钻入土中越冬,10月份地温2-9时,幼虫死亡成为僵虫,接着大量菌丝穿过体壁包住周围的土壤颗粒,形成一薄层的膜皮;随着地温不断下降,僵化程度越来越高,并形成菌核。当环境条件一旦好转,菌核的菌丝反复扭结、分化从虫体开孔部位或柔软部位穿出体外形成肉眼可见的繁殖器官——子实体。11月至次年2月份,地温极低,子座生长非常缓慢甚至停止生长。4月下旬地温升至5.5时,子座恢复生长。5月初,冰雪融化,土层解冻,子座钻出表土。出土的子座前几天生长最快,10-2 0 d子座呈现棕褐色,顶部开始膨大成圆柱状的子囊座,子囊座内有许多子囊壳,子囊壳内有子囊,每一个子囊含有2-8个线性子囊孢子。25d后子座停止生长,48d后线形子囊孢子成熟[26]。子囊孢子成熟后50天左右子囊孢子开始弹射。子囊孢子飘浮在空中或散落地面,可再侵染又一代虫体。在高山草甸中,完成一个有性世代需352-379d

冬虫夏草一般只有一条子实体,呈细长的圆柱形,长4-7厘米,直径约0.3厘米,基部将虫体头部完全包裹。子座的表面是深棕色至棕褐色的,有细细的纵向皱纹,上部稍为膨大,顶端较尖、光滑。成熟的子坐可分为柄部、可孕部和不孕部三部分,可孕部为繁殖子囊孢子进行有性繁殖的场所;柄部无子囊壳,由数根(4-8根)菌丝在黏液聚集下形成菌索,菌索再平行排列而成,单根菌丝直径约为2.5µm。

随着冬虫夏草的成熟,子囊孢子也逐渐发育成熟。子囊孢子的发育可分为三个阶段,(1)原子囊孢子期:孢子近球形,椭圆形,4.8103.6m;(2)孢子伸长期:从孢子一端突出,伸长生长,出现分隔,隔细胞较长,3037.5µm;(3)子囊孢子形成期:孢子继续伸长并不断出现分隔,隔间长612µm。一般仅有两个孢子成熟,其余多数原子囊孢子败育,不萌发或形成极纤细的丝状物[92]

 

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冬虫夏草子实体

1.1.3子囊孢子

冬虫夏草子实体成熟后,进行有性繁殖,在可孕部形成孢子囊,最后喷发出子囊孢子。

冬虫夏草的子囊孢子有自发荧光,为两端尖细、中间有分隔的线状结构,长约6-12µm,直径3.6-6µm,隔细胞长约 30-37.5  µm。

子囊孢子在一定条件下可萌发,与营养、温度、湿度、氧气、光照、酸碱度密切相关。条件合适时,一般3天后开始产生牙管,在牙管的顶端产生次生的分生孢子,有的牙管还可分化出较小的菌丝。分生孢子顶生,肾形,着生在分生孢子梗顶端。分生孢子进一步萌发产生新的菌丝体[93.94.95.96],。牙管在菌落早期可分化出穿透钉结构,可帮助穿透幼虫体壁导致感染发病。

 

F:\孢子囊\DSCN0711.JPG

 

冬虫夏草子囊孢子

 

F:\孢子囊\DSCN0723.JPG

 
子囊孢子自发荧光
 

对于异宗结合的真菌,子囊孢子的单孢子分离物(单核菌丝体)原来是不孕的,不能形成正常子实体,,只有由不同性别的彼此亲和的单孢子菌丝体接合成的双核菌丝,才能产生正常的子实体。冬虫夏草的有性繁殖机制到底是同宗结合还是异宗结合尚没有定论。

 

1.2冬虫夏草无性型

与有性型子实体不一样,冬虫夏草无性型具有一系列特点:

一是生长速度极慢。其单孢子菌株一个多月后才形成肉眼可见的菌落。

二是嗜低温。其最适生长温度12-18,22长时间放置就会死亡。

三是低耗氧。这是青藏高原地区缺氧环境自然选择的结果,给过多的氧气会抑制生长。

四是易自溶。培养过程中将菌体断裂后,源环境继续培养,容易引起菌体死亡而自溶。

冬虫夏草的无性型大多具有独立的生活能力,包括虫菌体、菌丝体、分生孢子三种形态。

1.2.1虫菌体

虫菌体为为冬虫夏草菌在寄主幼虫活体内寄生阶段存在的形态,为侵染菌体以裂殖方式形成,可随体液流动到身体各部位。虫菌体呈短棒状,显微镜下可见分隔。

 

 
虫菌体

1.2.2菌丝体

菌丝体为冬虫夏草菌在腐生阶段穿出虫体后的存在形式,有自发荧光,呈丝状结构,分枝,靠顶端生长方式不断延伸,显微镜下菌丝粗细不一,有明显的隔膜,每隔由均质的物质构成。菌丝体无色,在固体培养基上呈半透明状菌落,后期可分泌棕色色素分布在菌落周围,液体培养基则表现为液体颜色越来越深。在菌丝体发育到一定阶段可融合成出大的菌丝,有的可形成孢子梗,产生分生孢子繁殖后代。子囊孢子、虫菌体、分生孢子均可形成菌丝体。

 

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菌丝自发荧光 

 

菌丝3染色40.BMP 

          

液体培养的菌丝体

 

fungizz-40 

 

 天然僵虫组织内生长的菌丝(40倍)

 

 F:\虫草\粗菌丝1染色40.BMP

固体培养基生长的菌丝(40倍)
有的菌丝融合后粗大,棉酚蓝染色。
                                  

1.2.3分生孢子

分生孢子为菌丝体发育到一定阶段形成的无性繁殖后代。当菌丝体发育到一定程度或环境不利时,菌丝的顶端会膨大形成分生孢子梗结构并产生无性的分生孢子。分生孢子长椭圆形或肾形,无色,光滑,单细胞,8-12x3-4µm,通常2-4个一群,为一柠檬形粘被膜所包围。

 F:\虫草\分生孢子2染色.BMP
 分生孢子梗和孢子囊 棉酚蓝染色
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分生孢子

二、冬虫夏草寄主昆虫

 

冬虫夏草菌的寄主昆虫属于节肢动物门、昆虫纲、鳞翅目、蝙蝠蛾科、蝙蝠蛾属。虫草蝙蝠蛾是冬虫夏草菌的主要寄主,但不是唯一寄主,还包括康定蝠蛾、玉树蝠蛾、斜脉蝠蛾等不同种或变种,在自然界中,每一个虫草分布地块都只有单种虫草蝠蛾种群,但各种虫草蝠蛾的生活规律、生物学特性、空间分布都相同[39]

虫草蝠蛾生活周期3-5年,以幼虫的形式越冬,土栖,世代重叠,经历卵、幼虫、蛹、成虫四种生态[40]

 

2.1

在产区卵历期在6月下旬至9月上旬,卵期50-80天。一般成虫交配后一个小时左右开始产卵,卵椭圆形、散产,散落于布满草丛的土表,有变色的特性,从乳白变为淡黄-黄褐-黑色,全程6-12小时。未受精大部分也能和受精卵一样变色,最后成黑色,但有小部分始终为白色。

卵的孵化:干燥的卵在室温下长期不能孵化。在保持合适湿度的情况下,室温16-20度,卵逐渐发育变大、变黑,头先破壳,然后靠自身来回摆动和爬行离开卵壳,孵化期27天左右,经5-6天幼虫全部出完。15度恒温孵化,约经35天左右出虫,5-6天出完;海拔3600气温10-15度要经40天才能出虫,5-6天出完。过湿的情况下,孵出的幼虫太小,容易淹死。影响卵孵化的因素为:(1)温度:在18范围内,卵期随温度升高而缩短,15左右孵化率最高;(2)湿度:湿度直接影响孵化率高低,卵产出后保湿培养,孵化率可达90%以上,如未及时保湿或卵期脱水,孵化率会随之降低,严重时甚至不孵化;(3)样品新鲜度:0-5保存30天大大降低孵化率,2保存30天不能孵化;(4)湿材料对孵化率的影响:以腐殖土和湿滤纸为好,同时注意避光(5)未受精的卵不能孵化。

受精卵的显微鉴别:未受精卵不能孵化。孵化前,将受精卵和未受精卵压碎在显微镜下观察,两者看不出差异,均为均质物。孵化10多天后,压碎在显微镜下观擦,受精卵则能看出有不均一的条状物质,未受精卵为均质物。

 

 

 

刚产下的卵 

 

 
产后2个小时的卵

2.2幼虫

幼虫期6-9龄,3-4年。刚孵出幼虫头部较大,体长2-3mm,体壁柔嫩、白色。孵出不久就钻入地下,整个幼虫期均在土中生活,入土深度与虫龄、温度、湿度、海拔有关,一般栖息于15-25cm处。生长到一定阶段自然蜕皮,每年4-5月、7-8月为两次蜕皮期,蜕皮期间不活跃、不取食。冬季幼虫呈休眠状态,虫体皱缩,扁平,几乎完全失去水分,刺破皮肤无体液流出,主要在冻土层中越冬,也有报道在冻土层以下不呈休眠状态,可以缓慢活动。4龄期的幼虫有假死性,4龄后的幼虫有互相残杀的习性,在土壤水分过高或过低时还有吐丝结茧的习性。大龄幼虫身长3-5cm,直径4-7mm,象老桑蚕,外表深黄色,背部有不少环纹和稀少黑长毛,活体环纹不如僵虫明显。腹部有8对足,中部的4对足最为明显,头部红色、有毛,呈三角状[48-55]

幼虫有如下生物学特性:

分布区域与海拔密切相关:该地区海拔3000左右以下,老百姓没有挖到过虫草,本试验特意多次采挖,尽管食物丰富,也没有挖到幼虫。

常年地下生活:幼虫孵出后即钻入高山草甸型的土壤中,行严格的土栖生活。入土深度以15-25cm居多,在土层中形成上下纵行、略为倾斜的隧道,与大的植物根须相连。较小的幼虫入土较浅,有的钻入植物根的内部,吃住在里面,老熟幼虫入土较深,吐丝筑成土室,卷曲其中。实验室内饲养的幼虫,贴紧底部构筑隧道,整个底部纵横交错,局部形成大的土室,幼虫可在里面回转。

幼虫对气温敏感,随土层温度的变化可自行上下移动。春秋季气温低,表层土温较高,幼虫活动较浅,多在10cm左右的深度活动,相对较浅,易采挖。夏季土表温度升高,幼虫活动较深,多在15cm左右生活,较难挖到。室内饲养的幼虫,由于土层薄,没办法利用这种调节功能。

通过蜕皮增长虫龄:幼虫取食一定时间后,身体生长发育,到一定程度后便依靠蜕皮进入下一个龄期。每次蜕皮前幼虫明显变粗变短,皮肤发黄,皱褶加深,不取食、不活跃。蜕皮后,头壳增大,和前胸均呈嫩白色,随着生长颜色逐渐加深,前胸回到黄色,头壳由淡黄、深黄、浅红到最后红色。一龄期30-50天,以后50-90天,自然状况下一个生活周期6-8龄、4年左右。

以休眠的形式越冬:幼虫具有超强的耐寒性,形成了独特的越冬机制。海拔3600m左右的试验点从每年的11月底进入冻土期,到第二年的3月底开始消融,约4个月左右。随海拔升高,冰冻期随之延长 。从山上养虫盒内的幼虫看,此时期的幼虫在冻土层隧道内身体皱缩,皮肤发黄,水分脱失,身体扁平,呈半僵硬的休眠状态。隧道内有结冰,用锐物刺激虫体,可见轻微扭动。剖开幼虫,无任何液体流出,整个虫体象一坨黄油。第二年入春后,气温回暖,土壤解冻,幼虫复苏取食,补充水分,又进入新的轮回。自然地放养的幼虫,由于冰冻的太结实,一点都挖不动,用钢钎砸**ヒ仓皇且桓霭椎悖薮酉率郑话旆ǹ吹阶匀环叛那榭觥

耐热能力差:在室内饲养的幼虫,夏季易发病,死亡率很高,冬季死亡率则低很多,与温度有明显的关系。将带虫养虫盒放在20度左右过夜,第二天幼虫全部死亡。说明幼虫经长期的自然选择,已经丧失了耐热能力。

对干湿度耐受力强:在非常干燥和非常超市的地方,幼虫都能生存。

生活独居:幼虫喜欢独居,不群居,它们之间都隔一定距离。低龄幼虫不加介质,长期群养在一起,相安无事。大龄幼虫饲养密度太高,不同幼虫隧道相连,可见相互追咬现象,不久感染死亡。不加介质饲养,大龄幼虫只要头部接触到其它幼虫就咬一口,被咬幼虫卷曲、打滚,最后全部死亡。

食谱广泛:幼虫的食谱非常广泛。除能认识的几种幼虫食物外,随机采集虫草产区10多钟不知名植物的较嫩根须进行单独喂养,幼虫都能采食。因食物发霉,幼虫缺乏食物时,还能采食土壤,从外表能清晰地看见发黑的食道线。喂食红色的胡萝卜时,可见食道线呈红色。小龄幼虫大都钻入食物的内部,吃住都在里面,以致换料时很难发现,容易被丢弃。在食物内吃住的幼虫,要比在隧道内吃住的幼虫白嫩、肥壮(见图2-13至图2-18)。

 

病虫害多:通过对采挖自然幼虫的长期饲养,发现幼虫病害很多,成活率低。镜检时,经常看到寄生虫卵或小的寄生虫在活动;饲养过程中,经常发现不同龄期的虫草菌僵虫;幼虫死后,经常长出雪白的菌落或绿色菌落;羽化虫蛹时,有时最后从蛹壳内飞出寄生蜂。我们能鉴别的主要常见病害有:白僵菌、绿僵菌、虫草菌等真菌性病、细菌性病,线虫病、寄生蜂等(见图2-19至图2-24)。

 
 

                     
冬虫夏草寄主幼虫
 

 

 

越冬状态的幼虫

 

  

          

 越冬状态的幼虫

 

 

 

幼虫食物及食痕

 

 

幼虫食住在植物根内
 

 

 

幼虫食物及食痕

 

 

幼虫食物及食痕
 

 

 幼虫食物及食痕

 

 

幼虫食物及食痕
 

   

 

幼虫寄生虫病

 

 

幼虫寄生线虫病

 

 

蛹寄生蜂

 

 

幼虫白僵菌病
 

 

幼虫真菌病

 

 

幼虫复合感染

2.3

自然土壤中有蛹的时期为5月下旬—8月上旬。5月初可见初蛹,随海拔高度升高而推迟,自然情况下蛹期35-40天,6月底即可羽化。先是老熟幼虫变粗变短,表皮皱缩变黄,隧道上半部加大、表面光滑形成一土室,脱最后一次皮后即变成初蛹。初蛹为乳白色,随时间的推移,后变成淡黄色、黄褐色,羽化前为深褐色。蛹呈长椭圆形,从腹面观察蛹体,头部两侧有复眼和双触,中央有上唇,上唇下方有一对下颚,前足和中足胫节位于下颚和触角之间。从背面观察蛹体,胸部可分前胸、中胸和后胸,前胸狭小,中胸大,后胸部分外露。在腹部的背腹面有几排棘状突起,可左右摆动做上下自由活动。成蛹后,蛹突破土室的顶端,随气温的变化上下升降。晚上气温低时在土层下部,中午气温高时,在土层上部,非常明显。羽化前,虫蛹深褐色,停留在土室上端的入口处。早期,蛹在蛹道内尾部朝上,头部朝下,羽化前都变为头部朝上,尾部朝下。蛹有雄雌之分,雌蛹肥大,尾部钝圆;雄虫瘦小,尾部尖削。

 

                      
  蛹(大的为雌,小的为雄)

2.4成虫

成虫期很短:自然成虫见于6月底至7月底,不到一个月,室内成蛹羽化的成虫最早见于64。成虫在整个生命期间不吃不喝,无需补充任何水分和营养物质,主要行羽化、交尾、产卵等生殖活动。成虫无趋光性,有雄雌之分。雌虫肥大,尾部钝圆,体长20-25mm;雄虫瘦小,尾部尖削,体长8-12mm,同蛹的情况一致。成虫以爬行为主,飞行能力弱,相比较雄虫比雌虫飞行能力强。成虫寿命3—7天,雌虫在产卵后、雄虫在交配后体力耗尽,即行衰弱而亡。成虫寿命短暂,但是生活史上最紧张、最繁忙的时期(见图2-4)。

成虫的羽化:羽化前期的蛹深棕色,位于隧道上端的土表面,通过外壳腹部棘突张开变横,体积增大,进一步将蛹固定出口,头部向下。羽化初期,成虫在蛹壳内蹬动,头部外壳也随之起伏,随力量的增大,头中部出现裂口,成虫便从裂缝处爬出,此过程2-3分钟。蛹壳留在原处,壳内残留有不均匀的薄层淡黄色液体。刚羽化出的成虫体表湿滑,翅膀贴紧体表,停在一个地方不动,过1-2小时后变得活跃,在爬行过程中,翅膀慢慢打开伸展,几分钟内伸展自如,雌虫在盒子的拐角、顶上的丝网边缘等处停留。雄虫则较活跃,频繁爬行、小飞。羽化时间一般集中在午后1点多钟。

成虫的交配:完成后熟的成虫在一起相互接触,雌虫趴在角落或顶端丝网上,翅膀不停地飞动,偶尔从尾部甩出乳白色分泌物。雄虫不停飞的靠近雌虫,抱住雌虫后尾对尾的接触进行交配,雄虫身体倒吊。交配结束后,雄虫主动离去。每天的交配发生在2000左右,最早发生在1940,交配时间30min以上,最长4个多小时。

成虫的产卵:交配后雄虫自行离开,雌虫开始攀爬,最短的两分钟后开始边爬边产卵,长的1个多小时后开始产卵,卵白色,一粒一粒的往下掉。有的雌虫爬着不动产卵。产卵次数1-5次不等,第12次产卵量约80%,持续时间可达10多个小时。产卵量300-600粒之间。雌虫产卵后不久即死亡,剖开腹部较小,仍有残余的卵10多粒。

未交配的雌虫也能产卵。卵白色,数量较交配虫明显减少。死后可见腹部较大,剖开可见大量没有产出的白色卵粒。

 

          
产卵后自然死亡的成虫(大的为雌,小的为雄)
 
 
 
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