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揭秘冬虫夏草第八章 冬虫夏草无性型产品的开发应用

冬虫夏草的本质是中国被毛孢真菌,包括有性型子实体和无性型虫体菌核两部分,蝙蝠蛾幼虫只不过是保障中国被毛孢真菌生长、发育提供营养的载体。据统计,天然冬虫夏草虫体部分占天然冬虫夏草总重量的三分之二以上,因此,可以说天然冬虫夏草主要由冬虫夏草的无性型组成。

人工培养的冬虫夏草无性型菌丝体,只不过是将天然冬虫夏草的蝙蝠蛾幼虫培养基换成了人工配制的复合培养基,复合培养基中一般还包含有与蝙蝠蛾幼虫类似的昆虫来源的营养成分,经现代科技证实,用其培养的产品与天然冬虫夏草的遗传特性完全一致,其组成成分、生物学功能与天然冬虫夏草基本一致,且不含天然冬虫夏草的尸毒成分,不存在重金属污染风险,完全可以作为天然冬虫夏草替代品使用。

现实中,由于对冬虫夏草的过度采挖,一方面使冬虫夏草物种面临灭绝的危险,另一方面对青藏高原的环境造成巨大破坏,因此人工开发冬虫夏草无性型产品作为天然冬虫夏草替代品有非常重要的现实意义。

人工培养冬虫夏草无性型的方法理论上有液体发酵和固体发酵两种,由于固体发酵不仅速度慢,而且难以将固体培养基与无性型剥离而得不到纯的无性型产品,缺乏衡量产品品质的指标,故固体发酵不适宜用于冬虫夏草这类高档产品的开发。液体发酵传统方法为液体深层发酵,其虽能在一定程度上提高冬虫夏草无性型产品的产量,但因其不适合冬虫夏草菌生长慢、低耗氧、易自溶的特点,获得的产品产量不高、品质不好,为此北京天壤冬虫夏草科技开发有限公司田向荣博士发明了冬虫夏草无性型的浅层静止培养法,解决了液体深层发酵存在的问题,使其产品理所当然的最有资格成为天然冬虫夏草的最佳替代品。

 

一、冬虫夏草无性型的液体深层发酵

 

冬虫夏草菌深层发酵是在抗生素和食用菌发酵技术基础上发展起来的。所谓深层发酵,就是将菌种培养在发酵罐或圆锥瓶内,通过不断震荡或通气搅拌,使菌丝体在液体深层处繁育的一种方法。这也是近代大规模生产微生物产品的基本方法。深层发酵具有多种用途,其发酵罐容量通常为几吨至几百吨,在短时间内获得大量菌丝和代谢物,既可用于制备药物或提取代谢产物,又可作为人类食品及动物饲料蛋白的来源,还可用于制备生产液体菌种。其生产的菌种具有生产快速、菌龄一致并接种简便的优点。

 

1、满足深层发酵的基本条件

1)满足菌种培养、扩大和检测的基本设施和仪器设备

包括试管、三角烧瓶、摇床、一级种子罐、二级种子罐、三级种子罐、无菌室、灭菌锅及分离、过滤、检测、抽提设备等。

2)通气条件

要求所通空气气量可控,无菌、无油污和无液滴。

3)温度控制

要求温度控制在15-18范围内。

4)培养基配制

选择和确定满足冬虫夏草菌生长的培养基成分并调定好PH值。培养基的成分包括水分、碳源、氮源、维生素和矿物质。

 

2、冬虫夏草菌丝的深层发酵

1)菌丝的生产工艺

一般采用3级发酵方法来生产。工艺流程为:斜面菌种摇瓶种子(一级种子)种子罐(二级种子)繁殖罐(三级种子)发酵罐过滤、收集烘干、压块。

 

A、斜面菌种 斜面菌种是指培养在试管斜面培养基上的菌种。如果原种以矿物油法或冷冻干燥法作长久保藏,使用时则必须先移接到新鲜的试管斜面上进行培养复苏。斜面菌种在扩大移钟时,必须取新鲜的,最好是正在生长的菌种,因为那样的菌种正处在生长旺盛期,接种后缓解期短,菌丝能迅速再生繁殖。

 

 

 

冬虫夏草试管斜面菌种
 

B、摇瓶菌种 就是将新鲜的斜面菌种接入锥形瓶液体培养基内进行连续震荡培养形成的菌种。

 

  

 

不同速度摇床培养的冬虫夏草摇瓶菌种
 

C、种子增殖 菌丝的深层发酵需要大量的种子,通常的接种量为发酵总量的10%-20%,为此一级种子必须扩大繁殖成二级种子,再扩大成三级种子,必要时还需扩大成四级种子。摇瓶种子扩大成一级种子前,先将摇瓶种子倾入盛有玻璃珠的无菌瓶中,剧烈震荡,以便将菌丝打断制成种子悬浮液,然后以10%的接种量接入二级种子罐内进行培养。

D、发酵罐培养 为保证顺利发酵,除加入发酵液量不超过罐容的60%-80%外,还必须确定温度、压力、通气量、搅拌速度等条件,加入适量消泡剂、增粘剂。

2)菌丝发酵过程中的中间测定

为保证深层发酵质量和掌握发酵的进展情况,在深层发酵过程中必须进行中间测定。基本内容包括:

A、纯度测定 一般是通过平板及酚红肉汤培养、油镜镜检观察有无细菌、霉菌等杂菌生长,目的是为了及时掌握并排除杂菌的污染。

B、活力检查 通过显微镜观察菌丝体边缘,可以了解菌丝体的粗细和分枝情况,并且可以注意到菌丝的着染力强弱情况。宏观上讲,以醪液能够静置5s而无菌泥下沉现象为活力强的判断依据。

C、其它测定 培养醪液应测残糖,一般要求总糖含量不得超过1.2%,氨态氮不得超过30mg/ml。此外,深层培养过程中还应定时测定菌丝量,常用的方法是经3000r/min离心10min处理后,测定醪液中的菌泥重(g)与醪液体积(L)之比。

 

二、冬虫夏草无性型的浅层、静止培养

 

冬虫夏草无性型的液体深层发酵技术虽能大规模培养出冬虫夏草菌丝并增加冬虫夏草菌丝的产量,但此液体深层发酵技术原本是为低海拔地区的普通真菌设计的,并不适合高海拔地区冬虫夏草真菌生长速度极慢、低耗氧、易自溶的特点,获得的产品具有产率不高(一般1%以内)、品质不好(菌体老化、自溶严重)的缺点。为此北京天壤冬虫夏草科技开发有限公司的田向荣针对冬虫夏草菌的特点,在反复总结相关实验成果的基础上,发明了冬虫夏草无性型的浅层、静止培养法,获得的产品产率高、品质好,可以说和天然冬虫夏草的无形性部分最为接近。该技术于2004年成型,2007年获得国家发明专利,2014年完成产业化工作。

浅层、静止培养法的核心内容可概括为两点:一是通过外力将冬虫夏草菌体变为菌丝段或单细胞碎片,极大增加生长点,变冬虫夏草菌丝的顶端生长方式为对数生长方式,从而大幅度提高产量。二是浅层自然给氧能满足冬虫夏草菌体对供氧的需求,而静止培养不引起菌丝断裂、自溶问题,且菌丝代谢产物在菌体内积累浓度高。通过此法获得的产品产率高、品质好、品相独特。

 

1工艺的确立

真菌发酵包括液体发酵和固体发酵两种,根据传统技术和我们取得的成果,我们在冬虫夏草菌产业化过程中确立采用如下工艺:

1.1液体培养

真菌培养可分为液体培养和固体培养两大类。根据传统工艺,液体发酵方法可以得到肉眼可见的高纯度无性型菌丝体产品,由于冬虫夏草类产品价格昂贵,目前没有确定评价冬虫夏草产品效能有效成分的标准,因此,菌丝的纯度是衡量冬虫夏草菌无性型品质的重要指标。固体培养,其培养基含量很难认定。因此我们选择更为有利的液体培养工艺。

1.2人工给氧技术的应用

液体发酵给氧包括直接接入无菌空气和使用摇床或搅拌器这两种手段。冬虫夏草菌虽适应了青藏高原的高寒缺氧环境,过多的供氧并不有利于生长,但冬虫夏草菌是绝对需氧菌补充适量的氧气能促进其生长。特别在菌种培养阶段,为了节约时间成本,使经济效益最大化,人工补氧以加快生长不失为有效手段。

1.3机械化捣碎菌种

在试验阶段,为避免污染,是通过磁力棒搅拌的方法来捣碎冬虫夏草菌种,以增加菌株数和生长点,但这种方法效率低、耗时长,不能有效控制。利用捣碎机原理用电动机械的方法既能达到目的又能能克服上述缺点。

1.4用浅层容器静止培养产品,自然给氧

根据已经取得的研究成果,用浅层静止、自然给氧的培养方法培养冬虫夏草菌产品成本低、产量高,但实现这一目标的关键是需要设计制造一种达到此目的的培养容器。

 

2产业化所需设备的研制

由于本技术工艺包含有独特性,目前市场上没有相应成品设备与之配套,需单独研制、改造和生产。

2.1产业化菌种培养设备

2.1.1菌种培养容器

容器大小:

根据工厂生产规模和自动化程度而定,我们已设计定型的产品容积20000ml,实际液体培养基装载10000ml,可接种500盒左右进行产品生产。

容器形状:

正四棱柱,便于底部安装捣碎部件和用最大面积平放静止培养。

底部设置:

在容器底部安装捣碎机一样的捣碎部件,容器内部为刀片,外部为与电动机快速联、拆接口,中间用耐高温无毒密封部件进行密封隔离。

顶部管、口设置:

容器顶端一侧设置通气管、接种口、进出料口。通气管要求便于过滤空气虑器的连接;接种口要便于密封,不怕火烧,不产生污染;进出料口要求便于封口虑菌介质的固定、放置。

材质:

容器选用耐高温、无毒、透明、不变形的聚碳塑料,金属部件选用医用标准不锈钢部件。

设计图:

见图5-4

2.1.2菌种捣碎电机

从市场上购买合适规格产品,对其接口进行改造,使其与培养容器的外部接口匹配,达到方便、快捷、安全的目的。

2.1.3菌种培养设备放置架

为节约空间,设置菌种培养放置架,一方面可批量培养菌种,另一方面,为增加菌种产量在静止培养期间倒置平放,达到浅层培养的功效。

 

2.2产业化产品培养设备

2.2.1产业化产品培养容器

材质选择:培养容器的材质必须符合下述要求:1、无毒、无味,不影响冬虫夏草菌的生长,所形成产品不能危害健康;2、透明,以便观察污染情况,适时清除;3、耐高温,因为生物培养需对容器进行120度高温灭菌;4、不变形,需在高温情况下不变形和冷却后承载一定的重压;5、经济,成本越低越好。我们经过反复试验和比较选某品牌型号的聚碳塑料最好。

容器的大小及形状的确定:根据已取得的成果,产品培养容器以扁平形状为宜,厚度4cm左右,越大越好,根据所选材质及性能设定。我们根据材质及性能,制作成宽30cm、长40cm、高4cm的扁平型容器,容积3000ml,实际装载量1500ml左右。

开口的设置:容器设置两个开口,为便于容器的吹制,在一边的上部斜向上方伸长,为加载过滤空气介质,减少移动容器时液体外溢造成污染,开口应高出容器上表面2cm左右。一个开口较大,直径4cm左右,主要用于进出料和静止培养时自然通气给氧;一个开口较小,直径1cm左右,主要用于接种,口部根据不同的密封材质和接种方法进行不同的设计。

过滤空气介质的选择:目前,过滤空气介质有四种,一是传统使用的绵塞,二是醋酸纤维虑膜,三是玻璃纤维滤膜,四是带陶瓷滤芯的硅胶塞。根据我们的实验,醋酸纤维虑膜高温灭菌时会收缩,使虑孔变小,影响通气性能;玻璃纤维耐干热,但在灭菌时湿热情况下会产生膨胀而失去通气功能;带陶瓷滤芯的硅胶塞,由于技术不过关,陶瓷滤芯的性能不稳定,污染率较高。因此选用传统的棉花介质安全可靠。

适于堆码结构的设置:冬虫夏草菌无性型的产业化,需要使用大量的培养容器,本方案设计的扁平容器必须堆码摆放以便合理利用空间。堆码层数与容器材质承受力有关,以最下层长期码放不变形为准,根据现有经验,以15层为宜。为符合堆码要求,一是在容器的上下面4角设置4个相互咬合的凹凸结构,以维持稳定;二是培养容器采用上下层交叉叠放,为避开口部的凸出部分,在同一容器的另一端设置凹陷结构,相互咬合,从而满足规模化生产的要求。

  
 
设计图:

2.2.2产业化产品培养容器放置架

根据需要,配置相应规格的商品货架即可满足要求。货架层数根据空间高度设定,每层可叠放15个培养容器。

 

2.3灭菌柜等的改进

冬虫夏草无性型的培养周期长达6个月以上,不同于一般的细菌或真菌,其培养周期仅几天至半月,对培养基的灭菌要求非常严格,必须杀死所有最顽固的真菌孢子。现在的灭菌装置只能检测灭菌室内容器外的温度和压力实际和容器内的温度和压力有很大的差异,导致灭菌不彻底,以致培养2-3月后出现真菌污染的情况,有必要对灭菌柜进行改进,加装温度探头,使其对灭菌容器内的培养基温度进行实时监测,保证灭菌效果(图5-1)。

 

3冬虫夏草无性型菌丝体的产业化生产程序

冬虫夏草无性型菌丝体按下述生产程序进行产业化生产(图5-3、图5-5、图5-6):

3.1纯净水的制备;

3.2菌种的培养、扩大;

3.3培养基的配置、灌装、灭菌和冷却;

3.4接种;

3.5静置培养;

3.6产品回收;

3.7多糖的提取;

3.8产品干燥、储存。

 

小结

通过确立冬虫夏草无性型菌丝体产业化的工艺,设计和改造了菌种、产品等培养设备,设计和建造了培养车间,实现了冬虫夏草无性型菌丝体的产业化生产,完成了从科研到产品的良性循环。

  

 
浅层培养试验结果                             培养车间一角
 

菌耳IMG_1579  依靠发明的方法培养出的菌丝体产品

 

浅层静止培养法培养出的干品                 浅层静止培养法培养出的鲜品 

 

三、无性型深、浅层两种培养方法的比较

四、无性型产品的有效成分

五、无性型产品标准问题的讨论

六、无性型产品代替天然冬虫夏草的必然性

 

1冬虫夏草的美中不足

1)过度採挖冬虫夏草危害物种安全

2)冬虫夏草的採挖破坏产地生态环境

3)重金属超标

4)含有尸毒成分

5)杀生

6)冬虫夏草供求矛盾凸显,已从保健品转化为奢侈品

 

2冬虫夏草成为国家管控品的一天必将到来

2015年底,习****总书记召开深改组会议,研究了三江源的环境保护问题。2016年初,国家药食局公布了冬虫夏草重金属超标问题,取消了冬虫夏草试点企业,这就等于剥夺了青海春天“极草”产品的市场准入资格。据青海、西藏的有关人士讲,如果不是当地牧民需要依靠冬虫夏草作为其主要经济来源,以及尚未出现与冬虫夏草最为一致的人工培育的替代品,国家早就管控冬虫夏草的采挖和上市了。

鉴于以上,深入研究冬虫夏草的活性成分并制定一个合适标准、开发出冬虫夏草替代品是摆在本领域科技工作者面前的主要任务。源头产品冬虫夏草研究存在的不足直接影响到对冬虫夏草替代品的认定。

 

七、开发无性型产品的环保意义

 

1过度採挖冬虫夏草危害物种安全

据媒体报道,“20076月至7月,由中国科学院西双版纳热带植物园组织的‘青藏高原濒危真菌——冬虫夏草自然资源状况’考察队,对西藏、青海、四川、甘肃和云南等省区的冬虫夏草主要产区进行了考察。考察队把考察所取得的资料数据与25年前这些地区的冬虫夏草资源状况进行对照,发现冬虫夏草资源正遭受着人为的灭顶之灾。在冬虫夏草收获的 5-7月期间,因经济利益驱动,每个出产冬虫夏草的地块均有成千上万的人成排成队地寻找虫草,有时同一地块每天有10多队人如此爬过。过去,人们对寄主虫体空瘪的冬虫夏草(这种状态的虫草已经失去药效)都是不采集的,现在,不管冬虫夏草在什么生长阶段,见到就采,哪怕虫体腐烂,仅剩子实体,也一网打尽。大部分地区冬虫夏草的产量不到25年前的 10%,原来分布密集区40%地块已经多年未发现生长冬虫夏草”。可见,冬虫夏草如今已面临着失去传宗接代、濒临灭绝的危险。

 

2冬虫夏草的採挖破坏产地生态环境

 

在巨大的市场需求和经济利益驱动下,人们对冬虫夏草的过渡采挖的势头越来越猛,不但导致冬虫夏草自然资源日趋减少,而且对长江、黄河、澜沧江、怒江、独龙江、雅鲁藏布江等数十条江河上游水源地带的草甸生态环境造成破坏。这些地带既被水文地质学家喻为“亚洲水塔”和“亚洲江源”,又被生物学家誉为“野生动植王国”,是世界自然基金会列为全球25个生物多样性重点保护地区之一,如果不能有效制止人为破坏,最终必将危及到我国和亚洲数十亿人口赖以生存的江源安全。

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