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揭秘冬虫夏草第六章 冬虫夏草菌种

 

菌种是国家重要的生物资然。它既是物种鉴定的依据,又是进行无性型产业化培养乃至冬虫夏草全人工栽培的种源。因此,搞好菌种的分离、优选和保藏,非常重要。

 

一、菌种的分离

 

冬虫夏草菌种的分离是一个在无菌条件下从冬虫夏草身上选取某部分组织进行纯培养的过程。

 

1、分离前的准备工作

1.1常用设备

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅等。

1.2常用器具

包括烧杯、试管、量筒、培养皿、酒精灯等普通实验室常用的玻璃器皿及接种针、解剖刀、铁架台、剪子、镊子等常用微生物实验室工具。

1.3消毒液

0.1%的升**溶液,乙醇、甲醛、高锰酸钾、去离子水等。

1.4培养基的配制

冬虫夏草菌对营养要求并不十分严格,在一般的培养基上均能生长,培养菌种一般用灭菌PDA培养基平板即可。培育出纯种后,可对培养基进一步优化,根据不同碳源、氮源、矿物质、生长因子等的配比,选出最适合的培养基。

进行子囊孢子分离时,因不好对子囊孢子进行消毒,最好能用抗生素药物培养基,以防止细菌污染。

 

2、菌种分离方法

冬虫夏草菌种的分离通常采用组织分离法和子囊孢子分离法。组织分离法由与组织的新鲜程度、选取的部位等密切相关,常分到假阳性菌,以子囊孢子分离法最为可靠。

2.1组织分离法

组织分离法是指在无菌操作的条件下,通过直接切取经过表面消毒的冬虫夏草子实体或菌核的小块组织,将其转移到培养基上进行纯培养的过程。

2.1.1冬虫夏草组织的表面消毒

冬虫夏草组织的表面消毒包括对子实体和虫体两部分的表面消毒。因冬虫夏草的子实体和虫体表面含有大量的杂菌,只有将其尽量杀灭才可能获得对冬虫夏草菌种的纯培养。

升**是目前获利最强的外用消毒剂。一般用0.1%的升**溶液侵泡几分钟再用无菌水清洗即可。也可用其它外用消毒剂替代,但灭菌效果相对较差,消毒程序需多试验几次以确保成功。

2.1.2冬虫夏草的组织分离

冬虫夏草子实体实际上就是菌丝体的扭结物,具有很强的再生能力。对其分离只要将其表面消毒并清洗后,通过无菌操作,切取小块放到培养基上在18左右进行培养即可。生长情况是2周后开始生长,最初由组织周围长出新的菌丝,向下深入到培养基中,向上形成灰白色的气生菌丝;2月后形成以组织为中心的菌落,3-4个月菌落直径可达1-2cm,菌落坚硬,突起且表面皱折呈蚯蚓粪状,灰白色至棕黄色,棕黑色色素扩散到菌落周围的培养基上。

 

菌核组织的分离是在无菌操作的条件下,用无菌刀切除经过表面消毒的虫体外层,避开肠道,切取内部的白色组织,压碎后将碎粒涂在培养基的表面,放18左右进行培养。1周后,可以看到组织碎片周围长出菌丝,下面的伸入培养基中,上面的为灰白色菌苔;2个月后形成以组织碎片为中心的菌落;以后同上。

 

一年后的菌落形态(正面)

 

F:\虫草\虫草D株菌落2-1.jpg

 

一年后的菌落形态(背面)
            

       2.2单孢子分离法

2.2.1子囊孢子的收集和萌发

采挖成熟的新鲜虫夏草完整菌虫复合体,放入15培养箱中养护。 清除子实体表面杂质,用无菌蒸馏水冲洗,常规方法进行消毒,置培养箱内培养,每天记录观察。待子囊开始弹射子囊孢子时,将开始弹射孢子的子实体伸入盛有生理盐水青瓶内的水中,充分洗脱子囊孢子,然后放入15 培养箱中35d,以便子囊孢子发芽。

2.2.2子囊孢子的纯化培养

将盛有15培养35d的子囊孢子液的青瓶摇匀,少量倒入2%琼脂平板中,静置510min,用单孢子分离器分离单孢子。也可待水被吸入琼脂后,显微镜下,挑取单个发芽的子囊孢子接入分离培养基平板中。每个平板均匀接入68个,放入15培养箱中培养,用胶带封口防止水分散失。可经常用显微镜检查子囊包子的生长情况,但每次时间不能过长,因显微镜光源较热,照射时间长了易将子囊孢子热死。

 

 

纯分离出的半个月左右的单孢子菌落
 

单子囊孢子菌的生长情况是,3-6天便可萌发出芽管,15天后可见芽管伸长、分枝并开始形成菌丝,1个月后有细小无色的菌落出现,1个半月左右有的牙管可分化形成穿透钉结构。2个月后菌落直径发展到2-6mm,半透明×色;3个月便有很短的灰白色气生菌丝;4个月后菌落直径达1-2cm,菌落突起且表面皱折呈蚯蚓粪状,灰白色至棕黄色,棕黑色色素扩散到菌落周围的培养基上。

 

 

4个月左右的菌落
 

不同的冬虫夏草单子囊孢子菌进行液体摇床培养时可能会表现出各自不同的特点。我们发现主要有两种,一种是和正常的丝状真菌一样能看到菌丝并形成菌球,这种产量较高;还有一种震荡培养后看不到菌丝,形成的球状产物像太岁一样,呈肉质、半透明并有一定粘性。我们曾怀疑这是污染了杂菌,但通过再做DNA检测,证实为冬虫夏草中国被毛孢真菌。

直到目前,从组织分离出的菌种都培养出过有性型的子实体,尚未见从单孢子菌种上分化出子实体的报道,这可能与冬虫夏草菌的有性繁殖机制有关,即冬虫夏草真菌可能是异宗结合的真菌。

 

二、菌种的选育

 

所谓菌种的选育,就是选择和培育优良菌株,用以取代或改革原有菌种,以提高产品的产量和质量,并使之不断适应工艺改革的需要。

 

1菌种选育的理论基础

然而,菌种的选育是建立在冬虫夏草真菌的变异和遗传基础之上的,与遗传物质DNA(包括RNA)的结构发生改变密切相关。所谓遗传是指下一代与上代间性状的稳定性,即种瓜得瓜,种豆得豆;而变异则是指这种稳定性状的改变,也即一母生九子,九子各不同。变异是自然界的普片规律之一,任何生物的任何形状都会发生变异,但如果没有遗传,也就没有相对的稳定,则任何变异也毫无意义。因此,一方面要打破遗传的保守性,促成菌种的变异,同时又要通过特定选择,将有益的变异性传递给下一代,从而不断选育出高产优质的菌株来。

 

2菌种选育的方法

菌种的选育包括通过自然选育、诱变育种和杂交育种三种手段。

1)自然选育:自然选育就是人为的选择菌种自发产生有益的变异。方法是先分离和收集各地的有关菌株,然后通过生产试验比较各菌株的生产性能,选留最优者。自然选育是最古老,但也是最简便、应用最广泛的选种方法。

2)诱变育种:诱变育种是指人工采用物理、化学等诱变剂来改变菌种的遗传性,给出较多的机会从诱变后的群体中筛选出优良菌株的过程。诱变剂包活紫外线、同位素照射等。诱变机理是诱变剂直接或间接作用于核酸遗传物质引起改变的结果。常见的变化有DNA链的断裂、氢键的断裂、嘧啶的水合化、胸腺嘧啶二聚体的形成、DNA分子内和分子间的交联等。

3)杂交育种:与诱变育种不同,杂交育种是指通过2个或几个亲株的染色体片段交换或重新组合来获得新的形状。通过对杂交亲代的选择,能够得到融合亲代优点而去除亲代缺点的优良菌种。

 

3、诱变育种不适合于冬虫夏草菌的选育

综合菌种选育的三种方法,冬虫夏草菌种的选育应该首选通过自然选种的手段来实现,其次谨慎采用杂交育种的方法,不适宜选择诱变育种的方法。

因为目前对冬虫夏的有效成分研究还不深入,很难确定冬虫夏草的功能是有哪些具体成 良好作用是因为其是一个天然大复方。因此,现在合理的选育方法只能是尽量保持菌种的野性,去选择自然界已经存在的优良品种,而不应采取人为的方法去改变菌种的特性再进行选择。

 

三、菌种的培养

 

冬虫夏草菌种的培养,就是通过人工的方法扩大从野生冬虫夏草组织中分离出的菌丝量。以获得大量可用的菌丝体或达到形成子实体的目的。

 

1、菌种的移植

菌种的移植是菌丝培养的开端。通过有效的移植,既能扩大菌丝培养的规模,还能避免菌种老化或生长不良,而且还可以防止或消除杂菌对菌种的污染。

从子囊孢子分离培养或组织培养获得的菌种,在生产上均称为母种菌丝体,简称母种。母种一般是培养在固体的琼脂培养基上,该培养基具有营养丰富、表面光滑、杂菌在上面生长易鉴别等优点,非常适合母种的生产。

将母种进一步扩大,称为原种。待母种生长到一定程度后,用坚硬的接种针从母种菌落上挑取小块菌落组织,分别接种到各原种培养基试管上,经培养后形成原种。原种一般也培养在固体的琼脂培养基上。原种是由母种培养而来,主要用于人工扩大培养菌丝体产品。

菌种的移植必须在无菌操作条件下进行。操作人员必须经过较为长期的严格的规范的专业培训,在各环节如稍有不慎就会造成污染,前功尽弃。

 

2、对培养情况的监测

2.1性状观察

通过对培养菌种的性状观察,一是可以帮助了解菌丝生长与培养基的关系,有利于完善配方组成;二是可以获得一些菌丝生长情况量的依据和指标;三是有利于对无性阶段的分类鉴定。

性状观察一般在培养皿的固体培养基表面进行,记录指标主要包括菌落的质地、菌落表面的形状或有无成簇的菌丝体、形成孢子的情况(如干或黏、散布或成堆等情况)、菌丝有无特异气味的产生、菌落中有无部分成扇状的情况以及菌落生长的速度等等。对培养菌丝性状的描述,还要注意培养基的种类、培养温度、有无光照等情况,一般对于同种菌种需设置多种培养基及不同的培养条件。

2.2生长测定

 菌种培养过程中,菌丝不断生长,到一定的程度还会形成分生孢子。由于孢子数量较少且难于检测,一般只是对菌丝生长情况进行测定。通过测定生长过程中菌丝体的生长量,一方面可以了解冬虫夏草菌丝的生长情况,包括生长速度、时间、菌丝量等生物学性状,认识和筛选适合菌丝生长发育的培养基,确定适合于冬虫夏草生物学性状培养的方案和操作步骤,另一方面还可初步预测出菌丝体的总体生长情况。

测定的内容就是通过测定培养过程中菌丝增长的量及所耗费的时间,计算出他们的比值,从而得出它的生长率。测定方法主要分为直接测定法和间接测定法,通常采用的是直接测定法。

直接测定法包括目力估测、直接培养、湿重测定和干重测定等。

目力估测:就是通过直接观察固体培养基斜面上菌丝分布的多寡来估测菌丝生长量。此法虽不精确,但作为初步考察很有价值。

直接培养:就是把菌种移植到平面固体培养基上,每隔一定时间测定菌落的半径或直径。由此可计算菌落面积的扩大速率,大致得到近似“S”形的生长曲线。这种方法无法测定菌丝内物质积累以及菌丝生长的厚薄、疏密,但在研究菌种生长与温度、PH值关系等方面比较可靠。

湿重测定:一般用来测定通过液体振荡或通气方法培养的菌丝生长情况。用于固体培养基时,要注意将琼脂溶化除去。

干重测定:即在湿重测定后进行干燥,再进行测重。这种方法比较精确,但须注意干燥方法的一致性,确保数值准确。

 

3、培养方式

菌种培养通常采用静置、震荡和通气这三种方法。一般依据不同需要选择适当的培养方式。

1)静置培养法:就是在整个培养过程中,仅维持温度条件,不施加任何外力因素,在培养基上静止的培养冬虫夏草菌丝。这一般适用于菌种的分离及以诱导子实体为目的的人工栽培。

2)震荡培养法:是指通过不断震荡液体培养基来培养冬虫夏草菌丝。震荡的作用包括两个方面,一是使得液体中各成分混合均匀而不致沉淀,以免导致液体浓度不均的弊端;二是促进了容器内气液两相间接触,使气相中氧气有更多机会进入到液相培养基中,从而有利于菌丝的生长发育和增加菌丝的新陈代谢。

3)通气培养法:通气培养法效果同震荡培养法,但适用于规模较大的菌丝培养,如工厂化的液体深层发酵。其方法是通过外力可控的供应无菌、洗涤的空气,以促进菌丝的生长发育和增加菌丝的新陈代谢。 

 

四、菌种的鉴定

 

冬虫夏草是虫草属真菌寄生在昆虫蝙蝠蛾类上的结合体,探明一种虫草和其无性型的真正联系不仅可以丰富真菌分类学自身内容,发现一些新的生物资源,而且也是保存、研究和利用虫草的前提[70,71]。无性型的鉴定方法可分两类:传统方法和分子生物学方法,前者包括子实体的诱导、微循环产孢和多次多批量分离等;后者包括rDNA测序和随机扩增多态性DNA

4.1虫草子实体的人工诱发 按柯赫法则(Koch`s postulate)确定冬虫夏草无性型最可靠的方法是在实验条件下,将用各种途径分离获得的假定无性型,人工感染寄生昆虫,诱发形成具有成熟子囊壳的虫草子实体[48,71]。目前人工诱导冬虫夏草子实体技术还不成熟,因此,虽然这种方法最可靠,但难度较大,很难在无性型鉴定中推广应用。

4.2判定无性型的标准 由于冬虫夏草子实体形成条件苛刻,大量的无性型菌株在人工培养条件下不能形成有性子实体。为此,有关研究人员提出了其他判断无性型的方法。Kobayasi1941)在总结前人研究的基础上确定了虫草无性型的5条标准:1)虫草子座的一部分或其分枝的变成产分生孢子的束丝;2)在形成虫草子实体的菌丝体上同时形成的无性产孢结构;3)与虫草子实体同时出现在同一寄生昆虫体上的无性产孢结构;4)在同一地区、在长虫草子实体的同种昆虫的不同虫体上同时观察到的无性产孢结构;5)虫草的子囊孢子接种在培养基上形成的无性产孢阶段[72]。虽然这些标准对目前尚不能人工培养的虫草比较实用,但无性型的误定常有发生。不过这些建议为认识虫草菌属菌物的无性型提供了一些证据和线索,对无性型的确定起积极的作用,至今这些原则和方法仍有重要价值[48,71]

4.3 子囊孢子的微循环产孢 微循环产孢(Microcycle conidiation)是丝状真菌中分生孢子萌发后菌丝生长阶段的一种重复产孢现象。梁宗琦)(1991)提出,根据子囊孢子微循环产孢的方法确定虫草的无性型不仅简便、可靠,且具有很高的实用性[71]。刘作易等(2003)用微循环产孢的结构证明冬虫夏草与中国被毛孢的产孢结构相似,由此证明冬虫夏草的无性型应是中国被毛孢,中华束丝孢为中国被毛孢的同物异名[73]。莫明和等(2001)利用改进的子囊孢子弹射法,观察子囊孢子进行微循环产孢形成的瓶梗和分生孢子的特征与中国被毛孢的特征基本一致,再次证明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[74]

利用子囊孢子的微循环产孢确定虫草无性型,确是一种简便可靠的方法,具有很好的实用性。但不同种的虫草菌次生子囊孢子萌发和微循环产孢的条件各不相同,因此在只获得少量子囊孢子的情况下未必能实现微循环产孢的操作。

4.4其他传统方法 王伟等(1998)在研究中国虫草无性型的过程中总结出一套方法,主要包括以下几项:①用罹病虫体、内菌核和子座作组织分离并纯化,多批次多途径分离培养后相互验证为同一种真菌;②成熟的子座发射子囊孢子,反复洗净后挑取萌发的单孢子进行纯化培养;③同时进行组织分离和子囊孢子分离,培养物相互验证;④小试发酵后的培养产物与天然中国虫草比较,具有相似的功能成分和化学组成,聚丙烯酰**凝胶电泳后呈相同的蛋白区带,火箭线状免疫电泳证明两者具有相同的抗原性和交叉的血清学关系;⑤纯培养产物与天然中国虫草在药理上比较的一致性。按照严格的理论,这些间接的方法当然不能最终确定冬虫夏草有性、无性的真实关系,将这些方法同时交替使用并严格相互验证(尤其是第1,23项方法),可以很大程度上避免错判[69]

刘锡进等(1989)提出多途径多批次的培养方法,这种方法对获得正确无性形有一定的帮助[38]。不过,在分离中反复出现的同一种菌并不能确定就是冬虫夏草的无性型,而未分离到的菌种也可能是真正的无性型。有些研究者根据药理和化学成分与天然冬虫夏草的相似性来支持冬虫夏草无性型的确定。显然这些不能说明分离菌种与冬虫夏草的确切关系,均为一些间接手段。

4.5分子生物学方法 传统方法包括多途径多批次分离确定、微循环产孢和诱发子实体等,存在鉴定时间长或不能完全排除互生、伴生、混合感染其它菌株的可能性等缺点,而DAN分子标记技术的出现,可提供一种从分子水平快速、高效、可靠地鉴定冬虫夏草无性型的方法。

赵锦等(1999)采用分子生物学手段,以rDNA ITS1为分子指标,对采自西藏冬虫夏草的有性和无性阶段进行比较分析,从分子水平证明冬虫夏草的无性阶段是中国被毛孢[58]Chen等(2001)对不同来源虫草ITS1间区 5.8SrDNAITS2间区扩增并进行全序列的测定,也证明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢,并认为冬虫夏草应该只有一种无性型,其他的则可能只是一些同时(或随后)生长在虫体上的嗜昆虫生真菌,或者是其他长在或附在虫草菌上的杂菌[59]

Kang等(2001)用真菌通用引物ITS1ITS2ITS3ITS4对冬虫夏草、甘肃虫草及蛹虫草的5.8SrDNAITS2间区进行扩增,然后测序并进行了同源分析,结果显示冬虫夏草与甘肃虫草同源性为100%,与蛹虫草同源性为75%。形态学研究发现冬虫夏草的孢子为纤维状,而甘肃虫草的孢子为椭圆形。因此仅通过孢子的形状对虫草菌分类显然是不准确的[75]

章为民等(2002)从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出3个菌株C3、C4、C5,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法,以rDNAITS区为分子指标,与冬虫夏草的有性世代及中国被毛孢进行比较分析,发现C4的培养特征与C3、C5完全不同,其序列与冬虫夏草的相似率为93%,与中国被毛孢的相似率为94%,而C3、C5与冬虫夏草的相似率很低(分别为55%69%),从而证明C4是西藏冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[76]

张云武等(1999)利用18个随机引物获得来自高黎贡山、玉龙雪山的冬虫夏草和来自德钦地区的阔孢虫草的RAPD谱带多态性,遗传距离分析认为冬虫夏草与阔孢虫草间存在显著的遗传差异[77]Kang et al.(2000) 5.8SrRNA 基因及 ITS2 间区 DNA 序列的分析认为甘肃虫草与冬虫夏草的 DNA 序列相同,属于同一个种。冬虫夏草与阔孢虫草是2个种,还是同一个种的不同地理群?这个问题仍有待利用更多适当的方法和依据去验证[75]

李增智等(1999)从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢,并利用RAPD PCR技术,筛选出8种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组DNA指纹图谱,两者相似率高达96%,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[57]

分子生物技术的迅速发展并应用于真菌的种质鉴定,无疑给冬虫夏草的无性型确定提供了更客观的科学证据。运用现代分子生物学方法从基因水平证明应该是现阶段最先进、最可信的方法之一,但中国被毛孢是否为冬虫夏草真正的、唯一的无性型,还需深入研究。

 

五、菌种的保藏

 

菌种是国家的重要生物资然,也是进行科研和开展相关产业生产的首要原料。菌种的获得是非常不易的,不仅耗时、耗钱、耗力,而且有的因为野生资然的稀缺性,丢失后很难得到,有的选择到一个优良品种非常偶然,因此为了节约成本、保持物种和优质种源的延续性,搞好菌种的保藏非常重要。

 

1、菌种保藏的原理

要想物种得到较为长久的保藏,就是要降低其代谢强度并使之处于休眠状态。保藏手段包括干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法。代谢强度降得越低,保藏的时间则越长久。由于物种要存活必然或多或少的要有一定程度的代谢,其自身能量总有一天会耗光,因此,任何保藏方法都是有一定时间限度的。方法是根据试验确定保存期,到一定的时期对菌种进行复苏,重新补充能量,然后再进行保藏。

 

2、菌种保藏的方法:

(1)斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是指在加盖绵塞的试管中,将冬虫夏草菌种接种于斜面培养基上,待培养成熟后即移入4-6的低温下保藏,以后通过定期传代来达到储存的目的。这是最简单、最普通的菌种保藏方法。

(2)降低代谢速率保藏法

降低代谢速率保藏法基本原理是通过改变菌种生长条件,抑制菌种的物质代谢,延迟细胞衰老。此法包括液体石蜡保藏法、双重橡皮栓法、无机悬浮液保藏法等。

(3)冷冻保藏法

冷冻保藏法就是要将保藏的菌种进行冷冻,使其代谢活动曲玉停止、细胞处于休眠状态而达到长期保藏的一种方法。一般是在-196—-130的液态氮超低温冰箱内保藏,且适合保存所有的微生物菌种。

(4)干燥保藏法

干燥保藏法是指通过除去菌种细胞内的游离水,从而除去细胞内进行代谢的液相环境,从而使新陈代谢停滞并进入休眠状态。利用这种机制保藏的方法较多,常见的有砂土保藏法、土壤保藏法、干孢子真空保藏法、硅胶干燥保藏法等。

(5)真空冷冻保藏法

真空冷冻保藏法系采用真空、干燥和低温这3种手段来保藏菌种。显著优点是保藏期长,10-20年仍不降其原有性能,是目前应用最广泛、效果最佳的保藏方法。其基本程序是将需要保藏的菌种悬浮液装在特别的安培瓶内,然后骤然冰冻并立即抽真空,使培养物的固态升华脱水,熔封后在低温或室温下保藏。这种方法保藏的菌种运输方便,也不会遭到杂菌和螨类的污染。

 

3、菌种保藏的注意事项

1)一定要做好菌种保藏的记录。记录中必须注明菌种的名称、首次分离的时间、分离者的姓名和分离部位、采集地点、生物学性状及其它注意事项。

2)为了防止杂菌污染,同一种类的菌种要同时保存2-4支试管备用。

3)必须将首次分离获得的菌种作为原始菌株加以保存。

4)供长期储存用的冬虫夏草菌种,必须是遗传性纯种,为此至少要用单孢子或单菌丝分离获得的菌种。

5)对不同的菌种必须采用适当的培养基和适当的培养方法。

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